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エクソソーム アプリケーションノート1

血清Exosome由来のmicroRNA発現解析

-miRNAarrayとRT-qPCRでの再現性の検証実験-

通常miRNAarray(Agilent)実験ではtotal RNA100ngを使用します。しかしながら、今話題のExosome由来microRNAは微量なサンプルであり、その基準を満たすことは困難です。
そこで、健常人血清より単離したExosome由来のmicroRNAを用いた解析例をご紹介します。

目的

血清Exosome由来の微量microRNAを用いたArray実験およびqPCRによる再現性

実験解析方法

  • サンプル 抽出: 健常人血清よりTotal Exosome Isolation from serumおよびTotal Exosome RNA & Protein Isolation Kit(Life Technologies)を用いてExosome単離およびmicroRNA抽出を行った。血清量は1mlとし、N=2で実験を行った。
  • サンプルQC : Bioanalyzer pico kit(Agilent)により測定し、Array実験投入量を決定した。
  • Array実験解析 : Bioanalyzerの濃度で2ngと10ngを投入量とし、Human miRNA Microarray, Release 19.0, 8x60K(Agilent)を用いてProtocolに従い実験を行った。解析にはGeneSpring ver12.6.1を使用し、アレイ間補正(95percentile Shift)を行った。ScatterPlotにはシグナルの得られたデータのみを使用した。
  • RT-qPCR : TaqMan Micro RNA Reverse Transcription KitおよびTaqMan Universal Master Mix Ⅱ(Life Technologies)を用い、 ABI7500(Life Technologies)にて検証実験を行った。

結果・考察

Array実験の結果、投入量を揃えた場合再現性の高い結果が得られた(Fig1)。

Fig.1 ScatterPlot

実験投入量を揃えた再現性比較結果(10ng, 2ng)。
および同一サンプルの投入量の違いによる比較結果。

投入量が減るとシグナルが検出出来るmicroRNAが減ったが、同等の相関となった。しかし、2ngと10ngの比較では相関が下がることから、Array実験の投入量は出来るだけ揃える必要がある。また、Arrayの発現量はRT-qPCRと一致することが確認出来た(Fig2)。血清Exosome由来の微量microRNAでも発現解析が可能であった。

Fig.2 RT-qPCR

Array実験で得られた3種のmicroRNAについてRT-qPCRで得られたReplicate実験のCt値( Ct値:Threthold cycle)

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