トップへ

miRNA-Seq・Small RNA-Seq

特徴

  • Small RNAは、non-coding RNA(ncRNA)の一種です。遺伝子発現に大きく影響を与えることが知られているmiRNA やスプライシングに関わるとされるsmall nuclear RNA (snRNA) などのSmall RNA を網羅的に解析します。
  • 遺伝子発現に大きく影響を与えることが知られているmiRNA、および生殖細胞におけるトランスポゾン抑制に関わるpiRNA、およびmiRNAを含むSmall RNA の発現量比較や標的遺伝子予測などを行います。
  • 各種サンプルに対応しています。微量サンプルの解析に力を入れており、とくにエクソソーム由来Small RNAを用いた解析の実績が豊富です。
    ・細胞・組織由来の total RNA
    ・血清・血漿 由来 total RNA
    ・血中エクソソーム RNA
    ・血中 cfRNA
  • 解析対象に応じて下記のキットをご利用いただけます。
    ・miRNA-seq (miRNA、piRNA) QIAseq miRNA Library Kit(Qiagen社)
    ※分子バーコードUnique Molecular Indices(UMI)対応
    ・Small RNA-seq (miRNA、 siRNA、 piRNA 、scRNA、snoRNA) SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina(Clontech社)

サービス概要

1.サンプルのクオリティチェック

矢印 矢印

2.シーケンスライブラリー調製

矢印 矢印

3.シーケンス

矢印 矢印

4.データ解析

  1. サンプルのクオリティチェック(QC)を行います。
  2. miRNAまたはSmall RNAを対象としたシーケンスライブラリーを調製します。

    ライブラリー調製試薬
    QIAseq miRNA Library Kit(Qiagen社)
    SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina(Clontech社)
  3. 調製したシーケンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シーケンサー(NextSeq 500, NovaSeq 6000, Hiseq Xなど)でシーケンスします。
  4. シーケンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント(マッピング)後、発現量を定量化(正規化)し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルを作成します。デフォルトでは、TMMで定量化します。ご要望に応じて、 Small RNAの分類、発現変動遺伝子抽出、時系列解析、ターゲット遺伝子予測などの解析を実施します。

データ解析

miRNAの解析( ライブラリー調整キット:QIAseq miRNA Library Kit )

  • 1.リード品質の評価
    • 2.QIAGEN社クラウドサーバーによる
      miRNAのリードカウント
      • 3.Small RNAの分類
        • 4.正規化
          • 5.階層的クラスタリング
            &主成分分析(PCA)
            • 6.発現変動遺伝子抽出
              • 7.標的遺伝子予測
              • 8.予測された
                標的遺伝子のGO解析
                • 9.予測された標的遺伝子の
                  Pathway解析
  1. リードの品質の評価を行います。
  2. QIAGEN社クラウドサーバー( GeneGlobe Data Analysis Center )により、シーケンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント(マッピング)後、分子バーコード(UMIs)によるPCR重複の除去を行い、リードカウントをします。
  3. small RNA組成の分類を行います。
  4. サンプル間のリードカウントを補正するために正規化(TMM等)を行います。
  5. 階層的クラスタリングと主成分分析(PCA)を行います(6サンプル以上の場合)。
  6. ご指定の比較に沿って、変動するmiRNA等を抽出します。
  7. miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
  8. 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
  9. 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことができます。

解析内容は統計解析(データ解析)のページをご参照ください。

Small RNAの解析
( ライブラリー調整キット:SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina)

  • 1.リード品質の評価
    • 2.リファレンスゲノムへの
      アライメント(マッピング)
      • 3.Small RNAの分類
        • 4.正規化
          • 5.階層的クラスタリング
            &主成分分析(PCA)
            • 6.発現変動遺伝子抽出
              • 7.標的遺伝子予測
              • 8.予測された
                標的遺伝子のGO解析
                • 9.予測された標的遺伝子の
                  Pathway解析
  1. リードの品質の評価を行います。
  2. シーケンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント(マッピング)します。
  3. small RNA組成の分類を行います。
  4. サンプル間のリードカウントを補正するために正規化(TMM等)を行います。
  5. 階層的クラスタリングと主成分分析(PCA)を行います(6サンプル以上の場合)。
  6. ご指定の比較に沿って、変動するmiRNAおよびSmall RNA等を抽出します。
  7. miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
  8. 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
  9. 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。

解析内容は統計解析(データ解析)のページをご参照ください。

納品物

miRNAの解析( ライブラリー調整キット:QIAseq miRNA Library Kit )

  • original_fastq (FASTQ生データ)
  • サンプルQC結果(品質検査結果)
  • データQC結果(FastQC、MultiQC)
  • データ解析結果(正規化、変動miRNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析)

Small RNAの解析( ライブラリー調整キット:SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina)

  • original_fastq (FASTQ生データ)
  • Trimmed_fastq(トリミング済みFASTQ)
  • Bam(アライメントデータ)
  • サンプルQC結果(品質検査結果)
  • データQC結果(FastQC、MultiQC)
  • データ解析結果(正規化、変動miRNA抽出、変動Small RNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析)

※USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します

  • Small RNA の分類結果

  • Fold change による変動 Small RNA / miRNA の抽出結果

  • Small RNAのリードカウント正規化(定量化)

納期

  • サンプルのクオリティチェック(QC)通過後2か月程度
    (データ解析を含む場合は2.5か月程度)

サンプルについて

RNA量 濃度 OD260
/280
RIN値 送付液量
total RNA
(microRNA含む)
1μg
以上
100ng/μL
以上
1.5以上 8以上 10μL
以上
濃縮
Small RNA
500ng
以上
50ng/μL
以上
1.5以上 - 10μL
以上
エクソソーム
分画由来
total RNA
(miRNA含む)
1ng
程度
※1
- - - 10μL
以上
RNA抽出する
血清または血漿
400μL
以上
エクソソーム分画 ※2 - - - ※2
エクソソーム分離後
にRNA抽出をし、
miRNA-seqをする
血清・血漿・培養上清
- - - - 細胞培養上清:
15mL以上

血清・血漿:
2mL以上

※1 エクソソーム分画由来 total RNA は1ng からシーケンスライブラリー調製が可能ですが、全量で10ng を下回るサンプルはクオリティチェックが実施できません。ご注意ください。
※2 超遠心等で分画したエクソソーム分画の送付量については、予めご相談ください。

  • RNA抽出の際はカラムを使用し、有機溶媒が混入しないようにしてください。
  • サンプル量が上記に満たない場合はお気軽にご相談ください。
  • 採血の際に使用する抗凝固剤はEDTAをお使いください。ヘパリン使用の場合には、ヘパリナーゼ処理が必要になります。
  • 培養上清からエクソソームを分離して解析を行う場合、FBSにはウシ由来エクソソームが含まれているのでFBSフリーで培養することをおすすめします。FBSフリーでの培養が困難な場合、ウシ胎児血清中のエクソソームを除去するキットのご利用をおすすめします。
  • 送付方法はサンプル送付方法をご確認ください。

Contact

お問い合わせ

受託サービス・取扱製品に関するお見積もり、ご依頼、お問い合わせは下記より担当窓口へお問い合わせください。