miRNA-Seq・Small RNA-Seq 受託サービス

• RNA-Seq同様、 miRNA-Seq・Small RNA-Seqでもさまざまなサンプルに対応した解析を行っております。
  • 細胞・組織由来 RNA
  • 血清・血漿由来 RNA
  • 培養上清・血中エクソソーム RNA
• 細胞や組織由来RNAのほか、血清、血漿由来のセルフリーRNA（cfRNA）にも対応しており、近年、盛んに研究されているリキッドバイオプシーについても解析することができます。リキッドバイオプシーは体液に含まれる核酸を検出する技術であり、がんの検査などにも使われるようになってきました。
  とくにエクソソーム中のmiRNAの解析に関しては実績が豊富にあり、近年では動脈硬化疾患に関するプロジェクトに参画しております。
  
  「2021年1月14日プレスリリース　動脈硬化性疾患を対象とした共同研究プロジェクトへの参画 」 https://www.dna-chip.co.jp/news/press/20210114/

• miRNA-Seq・Small RNA-Seqは、次世代シーケンサーを用いてnon-coding RNA（ncRNA） の一種であるマイクロRNA（miRNA）やSmall RNAの配列情報を網羅的に読み取ります。その得られた配列情報を生物種別の既知の配列（リファレンスゲノム）にアライメントすることで、どのSmall RNAが発現しているか数値（発現値）に変換することで遺伝子発現を調べる解析手法です。

• miRNAは、18から25塩基程度の非常に短い小分子RNAで、メッセンジャーRNA（mRNA）に作用することで遺伝子発現の調整に影響を与えることが知られています。miRNAが調整する分野は多岐にわたり、発生生理機能に関わると言われています。
  とくに近年ではエクソソームの解析が進んでおり、その中に含まれるmiRNAのがんや生活習慣病への作用に対する解析が進んでいます。
  

• Small RNAは、miRNAを含むnon-coding RNA（ncRNA）の種類で、miRNA以外にもスプライシングに関わるとされる核内低分子RNA（small nuclear RNA, snRNA）や、リボソームRNAのメチル化を誘導する核小体低分子RNA（small nucleolar RNA, snoRNA）といったmiRNA以外のncRNAを解析することが出来ます。

• miRNAについて、miRBase（https://www.mirbase.org/）に搭載している生物種であれば基本的に解析可能です。miRBaseはmiRNAの配列情報やアノテーション情報に関するデータベースで広く利用されています。

• miRNA-Seq（miRNA）

  QIAseq miRNA Library Kit（QIAGEN社）
  ※分子バーコードUnique Molecular Indices（UMI）対応。PCRやシーケンスバイアスを最小限にし、個々のmiRNAを定量するように設計されています。

• Small RNA-Seq（miRNA, siRNA , piRNA , scRNA , snoRNA）

  SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech社）

1. サンプルのクオリティチェック（QC）を行います。
2. miRNAまたはSmall RNAを対象としたシーケンスライブラリーを調製します。
   
   ライブラリー調製試薬
   QIAseq miRNA Library Kit（QIAGEN社）
   SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina（Clontech社）
3. 調製したシーケンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シーケンサー(NextSeq 500, NovaSeq 6000, Hiseq Xなど)でシーケンスします。
4. シーケンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、発現量を定量化（正規化）し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルを作成します。デフォルトでは、TMMで定量化します。ご要望に応じて、 発現変動遺伝子抽出、時系列解析、ターゲット遺伝子予測などの解析を実施します。正規化以降の解析をご依頼いただいた場合には、 6サンプル以上の場合で階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います。​

miRNAの解析（ ライブラリー調整キット：QIAseq miRNA Library Kit ）

1. リードの品質の評価を行います。
2. QIAGEN社CLC Genomics Workbenchにより、シーケンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）後、分子バーコード（UMIs）によるPCR重複の除去を行い、リードカウントをします。
3. サンプル間のリードカウントを補正するために正規化を行います。
4. ご指定の比較に沿って、変動するmiRNA等を抽出します。
5. miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。遺伝子予測データベースであるTargetScan（https://www.targetscan.org）等を利用します。
6. 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。複数ある遺伝子の特徴を客観的につかむことが出来ます。
7. Pathway解析では、Wikipathwaysに登録されたPathway上に、予測された遺伝子をmiRNAの発現情報（UP/DOWN）で色分けしPathway画像を作成します。
   さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことができます。

解析内容は統計解析（データ解析）のページをご参照ください。

Small RNAの解析
（ ライブラリー調整キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）

1. リードの品質の評価を行います。
2. シーケンスで得られたリードをリファレンスゲノムにアライメント（マッピング）します。
3. small RNA組成の分類を行います。
4. サンプル間のリードカウントを補正するために正規化を行います。
5. 階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6サンプル以上の場合）。
6. ご指定の比較に沿って、変動するmiRNAおよびSmall RNA等を抽出します。
7. miRNAが標的とする遺伝子予測を行います。
8. 予測された遺伝子リストについてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
9. 予測された結果をもとに得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。さらに予測された遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。

解析内容は統計解析（データ解析）のページをご参照ください。

miRNAの解析（ ライブラリー調整キット：QIAseq miRNA Library Kit ）

• original_fastq (FASTQ生データ)
• サンプルQC結果（品質検査結果）
• データQC結果（FastQC、MultiQC）
• データ解析結果（正規化、変動miRNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析）

Small RNAの解析（ ライブラリー調整キット：SMARTer smRNA-Seq Kit for illumina）

• original_fastq (FASTQ生データ)
• Trimmed_fastq(トリミング済みFASTQ)
• Bam(アライメントデータ)
• サンプルQC結果（品質検査結果）
• データQC結果（FastQC、MultiQC）
• データ解析結果（正規化、変動Small RNA抽出、標的遺伝子予測、GO解析、Pathway解析）

※USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します

• サンプルのクオリティチェック（QC）通過後2か月程度
  (データ解析を含む場合は2.5か月程度)

※１　抽出後にRNAが10ng以上得られると想定される量をお送りください。液量が1mLを超える場合は限外ろ過フィルターなどで濃縮し液量を調整してください。

• RNA抽出の際はカラムを使用し、有機溶媒が混入しないようにしてください。
• サンプルQCにはサンプルを5µLを使用します。余裕をもってお送りください。
• RNAはDNase 処理を行い、DNA のコンタミネーションがない状態のサンプルをご送付ください。
• サンプル量が上記に満たない場合はお気軽にご相談ください。
• 採血の際に、使用する抗凝固剤はEDTAを使用して下さい。ヘパリンを使用した場合には、ヘパリナーゼ処理が必要となるため追加費用がかかります。
• 培養上清からエクソソームを分離して解析を行う場合、FBSフリー培地または、ウシ胎児血清由来エクソソームを除去したFBSを使用して培養していただくことをおすすめします。
• 送付方法はサンプル送付方法をご確認ください。