RNA-Seq(トランスクリプトーム解析)
特徴
- mRNA、lincRNA、non-coding RNAなどの配列を網羅的にシーケンスし、発現解析をします。
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マイクロアレイでは解析できない、エクソンレベルでの発現差解析、融合遺伝子の検出、
mRNAからの変異解析など豊富な情報が得られます。 -
ストランド特異的(Strand Specific)なRNA-Seq (トランスクリプトーム解析)を行います。
センス鎖、アンチセンス鎖を区別した解析が可能です。 - 様々なサンプル、解析の目的に対応しております。
- mRNA ( PolyA mRNA 精製 ) : PolyAを持つRNAを対象としたRNA-Seq。
- total RNA ( rRNA 除去 ) : rRNA以外のtotal RNAを対象としたRNA-Seq 。rRNAを除去後、RNA-Seqを行います。 rRNA除去により、poly-Aを持つmRNA だけでなくnon-coding RNAの解析も可能になります。
- FFPE由来サンプル:FFPE由来の分解が進んだサンプルに対応。rRNAを除去後、RNA-Seqを行います。
- 微量のtotal RNA:微量組織、ソーティング細胞由来のサンプルなど、10pg~1ng程度のピコグラムオーダーの微量サンプルに対応。
- 微量の細胞(1 ~ 500 cells): 1 ~ 500 cells程度の微量サンプルに対応。
- グロビンを多く含むサンプル(全血等):グロビン除去RNA-Seq。グロビンmRNA除去後、RNA-Seqを行います。グロビンmRNAを除去することにより、効率的なRNA-Seq解析が可能になります。血液試料を通常のRNA-Seqで行う場合、シーケンスデータの約1/4程度がグロビン遺伝子ファミリーに割り当てられる傾向があります。
サービス概要
サンプルのクオリティチェック
シーケンスライブラリー調製
シーケンス
データ解析
- サンプルのクオリティチェック(QC)を行います。
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サンプルの種類、分解度合い、解析の目的に応じたライブラリー調製キットを使用し、
total RNAまたはmRNAからcDNA合成後、シーケンスアダプターを付加したシーケンスライブラリーを調製します。
ライブラリー調製キット(Library Kit)は下記のものを取り扱っております。
ご希望のキットがありましたらご相談ください。
前処理試薬
- QIAseq FastSelect –rRNA HMR Kit(QIAGEN社)
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QIAseq FastSelect –Globin Kit(QIAGEN社)
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QIAseq FastSelect –rRNA/Globin Kit(QIAGEN社)
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NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module(NEB社)
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NEBNext rRNA Depletion Kit(NEB社)
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TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero H/M/R(illumina社)
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TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero H/M/R Gold(illumina社)
- TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero Globin(illumina社)
- NEBNext Ultra II Directional RNA Library prep for Illumina(NEB社)
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NEBNext Single Cell/Low Input RNA Library Prep kit (NEB社)
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SMART-Seq Stranded Kit(Clontech社)
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Ovation SoLo RNA-Seq Systems(Nugen社)
- TruSeq stranded mRNA(illumina社)
- 調製したシーケンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シーケンサー(NextSeq 500, NovaSeq 6000, Hiseq Xなど)でシーケンスします。
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シーケンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント(マッピング)し、発現量を定量化(正規化)し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルで納品します。なお、デフォルトでは、TPMで定量化します。その後、 Fold Change (およびt検定) による発現変動遺伝子抽出、階層的クラスタリング 、主成分分析 (PCA)などを行います。
ご希望に応じて、GO解析、パスウェイ(Pathway)解析、融合遺伝子の検出、スプライシングバリアントの検出、転写産物単位での発現差解析などの解析を実施します。
データ解析
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1.リード品質の評価
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2.リファレンスゲノムへの
アライメント(マッピング)-
3.発現データの正規化
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4.階層的クラスタリング
&主成分分析(PCA)-
5.発現変動遺伝子抽出
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6.GO解析
- 7.Pathway解析
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6.GO解析
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5.発現変動遺伝子抽出
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4.階層的クラスタリング
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8.融合遺伝子の検出
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9.新規スプライス部位の検出
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10.エクソンレベル、
スプライシングレベルの
発現差解析
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10.エクソンレベル、
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9.新規スプライス部位の検出
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3.発現データの正規化
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2.リファレンスゲノムへの
- リードの品質の評価を行います。生のリードデータから、アダプター配列やクオリティの悪い塩基をトリミング (除去)を行います。Ovation SoLo RNA-Seq Systems(Nugen社)をライブラリー調製に使用した場合は、分子バーコード解析ツールNuGEN NuDupによってPCR重複除去を行います。
- リファレンスゲノムへのアライメント(マッピング)を行います。全リード数の集計、およびアライメント(マッピング)した全リード数、染色体別リード数を集計します。
- サンプル間のリードカウントを補正するために正規化(TMM、TPM等)を行います。
- 階層的クラスタリングと主成分分析(PCA)を行います(6解析以上の場合)。
- ご指定の比較に沿って、変動する遺伝子を抽出します。
- 発現変動遺伝子についてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
- 得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。発現変動遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。
- 融合遺伝子の検出を行います。
- 新規スプライス部位の検出を行います。
- エクソンレベル、スプライシングレベルの発現差解析などを行います。
納品物
- original_fastq (FASTQ生データ)
- trimmed_fastq (トリミング済みFASTQ)
- bam (アライメントデータ)
- dedup_bam(PCR重複除去データ。 Ovation SoLo RNA-Seq Systems(Nugen社)をライブラリー調製に使用した場合のみ)
- サンプルQC結果
- データQC結果(FastQC、MultiQC)
- データ解析結果(正規化、変動遺伝子抽出、GO解析、Pathway解析)
※USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します。
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正規化データ(エクセル)
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GO解析結果(エクセル)
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Pathway解析結果
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ストランドを考慮した発現解析
納期
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サンプルQC通過後、2か月程度。
(データ解析を含む場合は2.5か月程度)
サンプルについて
RNA量 | 濃度 | OD260/280 | RIN値 | 送付液量 | |
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total RNA | 1μg以上 | 100ng/μL 以上 |
1.5 以上 | 7 以上 | 10μL 以上 |
FFPE 由来 total RNA |
500ng以上 | 100ng/μL 以上 |
- | - | 10μL 以上 |
微量 total RNA |
10pg ~10ng | - | - | - | 10μL 以上 |
細胞数 | 備考 | ||||
微量細胞 | 1 ~ 500 cells | 事前にサンプリングの方法についてお打ち合わせが必要です。必ず予めご相談ください。 |
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