RNA-Seq（トランスクリプトーム解析）

特徴

• mRNA、lincRNA、non-coding RNAなどの配列を網羅的にシーケンスし、発現解析をします。
• マイクロアレイでは解析できない、エクソンレベルでの発現差解析、融合遺伝子の検出、
  mRNAからの変異解析など豊富な情報が得られます。
• ストランド特異的（Strand Specific）なRNA-Seq （トランスクリプトーム解析）を行います。
  センス鎖、アンチセンス鎖を区別した解析が可能です。
• 様々なサンプル、解析の目的に対応しております。

• mRNA （ PolyA mRNA 精製 ） : PolyAを持つRNAを対象としたRNA-Seq。
• total RNA （ rRNA 除去 ） : rRNA以外のtotal RNAを対象としたRNA-Seq 。rRNAを除去後、RNA-Seqを行います。 rRNA除去により、poly-Aを持つmRNA だけでなくnon-coding RNAの解析も可能になります。
• FFPE由来サンプル：FFPE由来の分解が進んだサンプルに対応。rRNAを除去後、RNA-Seqを行います。
• 微量のtotal RNA：微量組織、ソーティング細胞由来のサンプルなど、10pg～1ng程度のピコグラムオーダーの微量サンプルに対応。
• 微量の細胞（1 ～ 500 cells）： 1 ～ 500 cells程度の微量サンプルに対応。
• グロビンを多く含むサンプル（全血等）：グロビン除去RNA-Seq。グロビンmRNA除去後、RNA-Seqを行います。グロビンmRNAを除去することにより、効率的なRNA-Seq解析が可能になります。血液試料を通常のRNA-Seqで行う場合、シーケンスデータの約1/4程度がグロビン遺伝子ファミリーに割り当てられる傾向があります。

サービス概要

1. サンプルのクオリティチェック（QC）を行います。
2. サンプルの種類、分解度合い、解析の目的に応じたライブラリー調製キットを使用し、
   total RNAまたはmRNAからcDNA合成後、シーケンスアダプターを付加したシーケンスライブラリーを調製します。
   
   ライブラリー調製キット（Library Kit）は下記のものを取り扱っております。
   ご希望のキットがありましたらご相談ください。
   
   前処理試薬
   
   • QIAseq FastSelect –rRNA HMR Kit(QIAGEN社)
   • QIAseq FastSelect –Globin Kit(QIAGEN社)
     
   • QIAseq FastSelect –rRNA/Globin Kit(QIAGEN社)
     
   • NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（NEB社)
     
   • NEBNext rRNA Depletion Kit（NEB社)
     
   • TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero H/M/R(illumina社)
     
   • TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero H/M/R Gold(illumina社)
     
   • TruSeq Stranded total RNA Ribo-Zero Globin(illumina社)
   ライブラリー調製試薬
   
   • NEBNext Ultra II Directional RNA Library prep for Illumina（NEB社)
   • NEBNext Single Cell/Low Input RNA Library Prep kit (NEB社)
     
   • SMART-Seq Stranded Kit（Clontech社）
     
   • Ovation SoLo RNA-Seq Systems（Nugen社）
     
   • TruSeq stranded mRNA(illumina社)
3. 調製したシーケンスライブラリーはQC後、illumina社の次世代シーケンサー(NextSeq 500, NovaSeq 6000, Hiseq Xなど)でシーケンスします。
4. シーケンス後のデータは、リファレンスゲノムにアライメント（マッピング）し、発現量を定量化（正規化）し、アノテーション情報を含むExcel形式のファイルで納品します。なお、デフォルトでは、TPMで定量化します。その後、 Fold Change (およびt検定) による発現変動遺伝子抽出、階層的クラスタリング 、主成分分析 (PCA)などを行います。
   ご希望に応じて、GO解析、パスウェイ(Pathway)解析、融合遺伝子の検出、スプライシングバリアントの検出、転写産物単位での発現差解析などの解析を実施します。

データ解析

1. リードの品質の評価を行います。生のリードデータから、アダプター配列やクオリティの悪い塩基をトリミング (除去)を行います。Ovation SoLo RNA-Seq Systems（Nugen社）をライブラリー調製に使用した場合は、分子バーコード解析ツールNuGEN NuDupによってPCR重複除去を行います。
2. リファレンスゲノムへのアライメント（マッピング）を行います。全リード数の集計、およびアライメント（マッピング）した全リード数、染色体別リード数を集計します。
3. サンプル間のリードカウントを補正するために正規化（TMM、TPM等）を行います。
4. 階層的クラスタリングと主成分分析（PCA）を行います（6解析以上の場合）。
5. ご指定の比較に沿って、変動する遺伝子を抽出します。
6. 発現変動遺伝子についてGO解析で特徴的なGO Termを抽出します。
7. 得られた全遺伝子をPathway上にマッピングし、Pathway画像を作成します。発現変動遺伝子を有意に多く含むPathwayを絞り込むことが出来ます。
8. 融合遺伝子の検出を行います。
9. 新規スプライス部位の検出を行います。
10. エクソンレベル、スプライシングレベルの発現差解析などを行います。

納品物

• original_fastq (FASTQ生データ)
• trimmed_fastq (トリミング済みFASTQ)
• bam (アライメントデータ)
• dedup_bam(PCR重複除去データ。 Ovation SoLo RNA-Seq Systems（Nugen社）をライブラリー調製に使用した場合のみ)
• サンプルQC結果
• データQC結果（FastQC、MultiQC）
• データ解析結果（正規化、変動遺伝子抽出、GO解析、Pathway解析）

※USBメモリ等の記憶媒体もしくはクラウド経由で納品します。

納期

• サンプルQC通過後、2か月程度。
  (データ解析を含む場合は2.5か月程度)

サンプルについて

• 国内ラボで実施の場合
• 海外提携企業先にサンプルを送付する場合はサンプル要件が異なり、より多くのRNA量を必要とします。別途お問い合わせください。
• サンプル量が上記に満たない場合はお気軽にご相談ください。
• 組織、細胞、FFPEスライド等は、DNA/RNA抽出をご確認いただくか別途お問い合わせください。
• 送付方法はサンプル送付方法をご確認ください。