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エクソソーム アプリケーションノート3

血漿Exosome由来のmicroRNA発現解析

~ miScript miRNA PCR Arrayによる再現性検証 ~

近年、血中バイオマーカーとして注目を集めるExosomeを含むEVs由来のmicroRNA(miRNA)は微量なサンプルです。マイクロアレイや次世代シーケンサーのバリデーションや、少量の血漿で少しでも多くのmiRNAを測定できないかとお考えの方へ、PCR Arrayという手段はいかがでしょうか。本アプリケーションノートでは健常人血漿より単離したExosome由来のmiRNAを用いた解析例をご紹介します。

実験解析方法

サンプル抽出・QC 

健常人男性2名の血漿サンプル(EDTA-2K)を0.8μmフィルター処理後、各200μLを用いてexoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit (QIAGEN)にてRNA抽出を行った(N=2)。Bioanalyzer Pico kit(Agilent)によりサンプルのクオリティチェックを行なった。

RT-qPCR実験解析

得られたRNA1.5μLを投入量とし、miScript II RT Kit(QIAGEN)を用いて逆転写反応をおこなった。プロトコルに従って得られたcDNAを用いてmiScript miRNA PCR Array Human Serum&Plasma MIHS-106Z(384well 4x96) (QIAGEN)にてqPCR実験を行なった。qPCRにはLightCycler®480システム(Roche)を使用した。 解析にはCel-miR-39にて補正した2-⊿CT値を使用した。

結果・考察

Bioanalyzer Pico kitの結果、small RNAのピークを確認するとともにrRNAなどの細胞由来のRNAが検出されておらず、RNAが精製されていることを確認した(Fig.1) 。

Fig.1 Bioanalyzer pico kitの波形

RNA抽出結果のsmallRNAピークの波形

RT-qPCRの結果、サンプルごとに高い再現性が示された。N=2の実験で健常人毎のCp値を並べると96wellの半数程が再現良く検出された(Fig.2)。

Fig.2 検出されたmiRNAのCp値
各健常人について検出されたmiRNAをCp値順に並べた結果

健常人2名について、 exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit (QIAGEN)プロトコルの推奨に従いSpike-Inとして添加したCel-miR-39にて補正を行ない、 2-⊿CT値を算出しScatter Poltにて確認したところ、検出されたmiRNAには高い相関が見られた(Fig.3)。

Fig.3 ScatterPlot

健常人2名の血漿に存在するmiRNAの散布図および相関係数

僅か200μLの血漿からPCR Arrayによって健常人に存在するmiRNAを再現良く検出することが出来ることが示された。少量の血漿においても十分なmiRNAの検出が可能であり、テクニカルレプリケートを加えることで、より結果として信頼性の高いデータを得られることが示唆された。

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